Ziel des Forschungsvorhabens war ein in-situ-Schnellnachweis für hygienerelevante Keime auf inneren und äußeren Endoskopoberflächen entsprechend Anlage 10 der Leitlinie zur Validierung von Endoskopaufbereitungsverfahren.

Der Nachweis einzelner hygienerelevanter Keime beruhte auf der selektiven Markierung mit Aptameren aus DNA, die nach der Markierung durch thermische Denaturierung wieder quantitativ von den Keimen abgelöst und aus dem Endoskop eluiert werden können.

Mittels Durchflusszytometrie konnte ermittelt werden, dass sich unter Einsatz eines Aptamers gegen Enterococcus faecium bis zu 40 % der Zellen markieren ließen.

Die thermische Ablösung gebundener Aptamere konnte bei 60 °C nachgewiesen werden. Wiedergewonnene Aptamere konnten durch Hybridisierung an komplementäre DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) auf spezifischen Auswertefeldern zum Nachweis einzelner mikrobieller Arten (z.B. S. aureus, Enterobacteriaceae, etc.) gebunden werden.

Zum Nachweis der gebundenen Aptamere wurden sphärische DNA-Hybrid-Aggregate (SDHA) entwickelt, diese konnten unter Einsatz von Goldnanopartikeln mit einem Durchmesser von 20 nm oder unter Einsatz von carboxylierten Latex-Beads mit einem Durchmesser von 1 µm durch Bindung von Oligonukleotiden mit teilkomplementärer Sequenz zu den nachzuweisenden Aptameren hergestellt werden.

Andere auf der Oberfläche der SDHA immobilisierte Oligonukleotide dienten als Initiatoren zur Auslösung einer hohen Anzahl (1. Amplifikation) von Hybridisierungskettenreaktionen (HCR).

Um mittels HCR fluoreszierende Hybridisierungsprodukte auf der Oberfläche der SDHA bilden zu können, wurden spezielle Fluorophor-funktionalisierte metastabile Haarnadel-Oligonukleotide entwickelt, die innerhalb von 10 min die Bildung hochmolekularer und stark fluoreszierender Hybridisierungsprodukte ermöglichten, die sich aus über 500 einzelnen Haarnadel-Oligonukleotiden zusammen setzten (2. Amplifikation), was eine empfindliche visuelle Detektion ermöglicht.

Den zunehmend mit der Aufbereitung von Medizinprodukten betrauten Reinigungs- und Hygienedienstleistern und den von den medizinischen Einrichtungen selbst betriebenen Aufbereitungseinheiten für Medizinprodukte wird durch das Duplex-Amplifikationsverfahren ein innerbetrieblich und kostengünstig anwendbarer Schnellnachweis zur eigenständigen, innerbetrieblichen Prüfung der Aufbereitungsqualität flexibler Endoskope zur Verfügung gestellt.

Der Forschungsbericht ist auf Anfrage bei FRT erhältlich.