Den zunehmend mit der Flächendesinfektion in medizinischen Einrichtungen betrauten Reinigungs- und Hygienedienstleistern sollte ein günstiger und innerbetrieblich anwendbarer Schnellnachweis zur Kontrolle des Hygienestatus von desinfizierten Oberflächen zur Verfügung gestellt werden.

Durch den Nachweis ergeben sich einerseits wirtschaftliche Vorteile für Reinigungs- und Hygienedienstleister, andererseits wird hierdurch die Hygiene in medizinischen Einrichtungen verbessert und das Risiko nosokomialer Infektionen gemäß § 23 Infektionsschutzgesetz (IfSG) reduziert.

Das Ziel war daher ein kultivierungsunabhängiger Nachweis für die simultane Detektion aller sechs nosokomialen ESKAPE-Erreger (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp.).

Der simultane Nachweis einzelner Zellen beruht auf der isothermalen Konvergenz-Amplifikation spezifischer DNA-Zielsequenzen, die ein einheitliches Produkt (Amplikon) als Summenparameter erzeugt.

Dessen Nachweis erfolgt durch einen immobilisierten Fluoroswitch, bei dem das Amplikon die Konformation des Fluoroswitch derart verändert, dass er von der gequenchten (switch off) zu einer fluoreszierenden Konformation schaltet (switch on).

Während der Projektbearbeitung konnten geeignete Zielsequenzen in der 16S rDNA identifiziert und die Konvergenz-Amplifikation erfolgreich entwickelt werden.

Durch die Verknüpfung aller Amplifikationsschritte in einer einzigen Reaktion gelang der Nachweis von Zielsequenzkonzentrationen von ≥2 nM und ermöglichte die Amplifikation von einzelsträngigen Zielsequenzen sowie von kurzen doppelsträngigen PCR-Produkten.

Die Differenzierung von DNA lebender und inaktivierter ESKAPE-Erreger durch Behandlung mit Propidiummonoazid (PMA) wurde erfolgreich demonstriert.

Der Fluoroswitch wurde modellhaft auf Basis von ssDNA mit terminalen Fluorophoren und Quenchern entwickelt. Dieses Modell wies eine gute Eignung als Fluoroswitch auf. Die Konformationsänderung bei Bindung des Amplikons, die Immobilisierung und die Regeneration durch RNasen konnten experimentell nachgewiesen werden.

Zudem gelang die Charakterisierung der Schaltkinetik zwischen OFF- und ON-Zustand. Auch die Kopplung von Goldnanopartiklen (GNP) an ssDNA war erfolgreich und demonstrierte das Quenching von Fluorophoren durch den NSET-Effekt.

Die Forschungsergebnisse zeigen, dass ein Schnellnachweis von ESKAPE-Erregern durch eine Konvergenz-Amplifikation und nachgeschaltete Fluoroswitch-Detektion möglich ist, sofern die Zugänglichkeit genomischer DNA, z.B. durch eine geeignete Probenvorbereitung, gewährleistet ist.

Der Forschungsbericht ist auf Anfrage bei FRT erhältlich.